Roepat Str - História

Roepat Str - História

Roepat

(Str: dp. 16.100; 1. 466'0 ", b. 55'11", dr. 28'9 ", s. 11 k .; cpl. 70; a. 15", 13 ")

Roepat (Id. No. 2536), construído em 1914 por William Hamilton & Co., Ltd., Glasgow, Escócia, para servir como um navio de transporte de animais Duteh, foi apreendido por funcionários da alfândega dos EUA, assumido e comissionado como um Naval Overseas Navio de serviço de transporte 17 de maio de 1918 em Nova York.

Após a reforma e reforma, Roepat carregou uma porção de suprimentos gerais do Exército e navegou em 2 de junho em comboio para Brest e St. Nazaire, onde descarregou sua carga. Ela voltou a Nova York em comboio em 30 de julho.

Carregando suprimentos do Exército em Norfolk, ela partiu em comboio de Nova York em 17 de agosto para Marselha, onde chegou em 6 de setembro para descarregar sua carga. Ela voltou a Nova York em 18 de outubro para se submeter a reparos e carregar cargas do Exército para Verdon, onde chegou em 18 de novembro. Ela voltou para Norfolk em 22 de dezembro.

Carregando uma carga para a Conta do Conselho de Navegação em Baltimore, ela fez um bunker em Nova Orleans e partiu deste último porto em 5 de fevereiro de 1919 para a Cette via Newport News. Descarregando sua carga de trigo e grãos remetidos ao governo suíço em 4 de março, ela voltou a Nova York em 6 de maio e passou por reparos.

Roepat partiu em 24 de maio para Portland, Maine, onde carregou uma carga para o Shipping Board e partiu no dia 29 para Amsterdam, onde chegou em 28 de junho. Em 30 de junho, Roe pat foi colocada fora de serviço e devolvida ao seu proprietário, Nederland Stoomvaart Maats chappij.


Introdução à repetição curta em tandem

Espero que todos estejam seguros e saudáveis ​​durante esses tempos infelizes. Minha última postagem foi em relação a ser um novo graduado do MLS e começar minha carreira como tecnólogo molecular no Laboratório de Transplante da Northwestern University. O tempo definitivamente voa!

Hoje, vou fornecer uma introdução básica sobre um ensaio que recentemente fui treinado, chamado Short Tandem Repeat (STR). Se você desse uma olhada em seu genoma, ele estaria repleto de muitas sequências repetidas. Embora existam muitas classificações diferentes de sequências de repetição, os STRs são um tipo de sequência de repetição em tandem em que cada repetição tem aproximadamente 2 a 7 nucleotídeos de comprimento. 1,2,3 STR é bem conhecido na ciência forense por ajudar a identificar um suspeito na cena do crime quando diferentes fontes de DNA estão presentes. No entanto, suas aplicações são muitas - desde a confirmação de linha celular, testes paternos e até a análise de quimerismo! 4

Imagem 1. Eletroferograma mostrando dois alelos diferentes (11 e 17) em 1 loco (D6S1043). O alelo 11 tem 11 repetições e o alelo 17 tem 17 repetições.

Os STRs são polimórficos, uma característica útil entre muitas, o que torna sua utilização na identificação da fonte de DNA particularmente vantajosa. Um alelo STR é definido pelo número de vezes que a sequência de repetição, definida acima, se repete. (Imagem 1). 1 Os indivíduos são heterozigotos ou homozigotos em cada locus. À medida que o número de loci STR sendo avaliados aumenta, o poder estatístico de discriminação aumenta e a probabilidade de outro indivíduo ter o mesmo perfil torna-se cada vez mais improvável e a detecção de pequenas diferenças aumenta. 3,4 Em nosso laboratório, avaliamos um total de 21 loci diferentes!

Além disso, em nosso laboratório HLA, utilizamos STR para monitorar o estado de quimerismo em pacientes que se submeteram a um transplante de células-tronco alogênico. Antes do transplante, os pacientes são pareados a um doador por meio de seu sistema HLA (diferente do STR). Assim que uma correspondência de HLA é confirmada, utilizamos o pré-transplante do paciente e a amostra do doador para gerar alelos informativos de STR. Alelos informativos são alelos que estão presentes apenas no receptor e não no doador. Esses alelos são importantes porque os transplantes de células-tronco substituem a medula do receptor e a detecção do DNA do receptor em amostras pós-transplante é crucial para identificar a rejeição ou recidiva de sua doença. Além disso, os loci que contêm alelos informativos são definidos como loci informativos, esses são os loci usados ​​para identificar o quimerismo percentual (Figura 2).

Imagem 2. Doador e receptor (pré-transplante) estão representados nos dois primeiros eletroferogramas. As marcas “D1R” verdes representam alelos compartilhados, as marcas “D1” azuis representam alelos específicos do doador e as marcas “R” marrons representam alelos específicos do destinatário. No primeiro locus, AMEL, não há alelos informativos e, portanto, não é um locus informativo. No próximo locus, D3S1358, há um alelo compartilhado, 15, um alelo do doador, 17, e um alelo informativo do receptor, 18. Loci informativos têm alelos informativos do receptor e podem detectar a presença de DNA do receptor em uma amostra & # 8211 em neste caso, todos os loci a seguir após AMEL são loci informativos. CD3 (pós-transplante) está representado no terceiro eletroferograma. Neste exemplo, fica claro que o paciente está tendo algum tipo de falha do enxerto ou recorrência de sua doença porque suas próprias células, ao invés de apenas do doador, estão presentes.

Quando as células receptoras começam a ressurgir, podemos detectar os picos de alelos relativos e atribuí-los ao receptor ou doador, referindo-nos aos alelos informativos. Os picos de alelos são então utilizados por meio de equações em nosso software que medem a área sob esses picos definidos e, em seguida, calculam um quimerismo de porcentagem do doador. Uma vez que esse relatório informativo é criado, podemos comparar qualquer amostra de procedimento pós-transplante para determinar o estado de quimerismo do paciente (Imagem 2).

Curiosamente, não isolamos simplesmente o DNA do buffy pós-amostra como faríamos com outras amostras. Em vez disso, separamos cada pós-amostra em um total de três subamostras. O primeiro é simplesmente o sangue periférico do paciente - nada extravagante. Os outros dois são isolados do resto do sangue periférico que não foi usado em duas linhagens celulares distintas - linfócitos (CD3 +) e mielócitos (CD33 +). Este processo é extremamente trabalhoso, sendo capaz de processar um conjunto de até 8-12 pacientes por vez e cada conjunto levando até 4-5 horas.

O processo começa aliquotando sangue periférico para isolamento de DNA (amostra 1) e pegando o restante e colocando-o em camadas sobre um meio de separação de linfócitos (LSM). Em seguida, coletar a camada de linfócitos / glóbulos brancos do LSM girado para baixo. Em seguida, adicionamos coquetéis de seleção de anticorpos CD3 e CD33 e contas magnéticas. Em seguida, fazemos uma série de lavagens com ímãs e, eventualmente, acabamos com nossas populações de células CD3 e CD33 purificadas. Sua pureza é determinada por meio de citometria de fluxo, um componente importante para confirmar que nossos subconjuntos de leucócitos não estão contaminados com outras populações de leucócitos - já que a contaminação anularia o propósito de analisar diferentes linhagens.

Finalmente, pegamos o DNA isolado das três subamostras e o amplificamos com primers específicos e marcadores fluorescentes por meio de PCR. Em seguida, as amostras são carregadas em um instrumento de eletroforese capilar. Este instrumento detectará cada comprimento de fragmento, definido pelos primers e as repetições dentro, e será capaz de identificar esses fragmentos por meio de tamanho, marcadores fluorescentes, lasers e detectores. O instrumento irá gerar dados que podemos levar para nossa plataforma de análise, que é o ChimerMarker. Com isso podemos analisar os dados e gerar nossos relatórios clínicos.

Embora extremamente demorado, o quimerismo específico da linhagem é crítico no transplante de células-tronco porque é mais informativo e sensível do que a análise total de leucócitos - sendo várias magnitudes mais sensíveis do que analisar apenas o sangue periférico sozinho. Ele permite a detecção precoce de pequenas populações de células quiméricas que, de outra forma, podem passar despercebidas, pois um subconjunto no sangue periférico pode “mascarar” outro subconjunto que tem uma porcentagem crescente de células receptoras. Diagnosticar essas pequenas populações de células quiméricas o mais cedo possível é crítico para intervenções terapêuticas e reduções nas rejeições de enxertos. 2,5,6

Além disso, não só a sua detecção é importante, mas através da nossa análise podemos calcular a percentagem de células doadoras e células receptoras. Muitas vezes relatamos a porcentagem de doadores (%) de quimerismo. Por exemplo, um paciente em 322 dias após o transplante poderia ter um quimerismo de doador de 96% em seu sangue periférico, 100% em sua linhagem CD33 e 73% em sua linhagem CD3. Então, no dia 364 pós-transplante, eles podem estar em 100% em seu sangue periférico, 100% em sua linhagem CD33 e 92% em sua linhagem CD3. Duas coisas a serem observadas neste exemplo são que as porcentagens estão mudando (aumentando no quimerismo do doador, neste caso) e que o sangue periférico expressou 100% de quimerismo na segunda amostra em 364 dias, mas quando olhamos especificamente para a subpopulação de CD3 aos 364 dias, ainda havia 8% das células receptoras presentes (Imagem 3 e 4).

Imagem 3. Amostras aos 322 dias pós-transplante. O sangue periférico relata 96% de quimerismo do doador. CD3 e CD33, purificados de sangue periférico, relatam 73% e 100% de quimerismo do doador, respectivamente. Imagem 4. Amostras 364 dias pós-transplante, mesmo paciente da Imagem 3 acima. O sangue periférico relata 100% de quimerismo do doador. CD3 e CD33, purificados de sangue periférico, relatam 92% e 100% de quimerismo do doador, respectivamente.

Alguns estudos se concentraram não apenas nas tendências de mudança de porcentagens, mas também em sua constelação de porcentagem relativa. Por exemplo, um estudo descobriu que o aumento das células CD3 do receptor tinha um fator preditivo aumentado de rejeição do enxerto. Também foi descoberto que outras populações de subleucócitos aumentaram esse poder preditivo. 5 Além disso, há alguns estudos que examinam o quimerismo e sua utilidade na previsão da doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD). Esta doença é definida por leucócitos do doador atacando os leucócitos e tecidos do receptor. Por meio dessas e de outras descobertas, o potencial e a aplicabilidade do monitoramento do quimerismo são extremamente cruciais para o atendimento ao paciente durante a progressão do transplante. 2,5,6,7

Embora o enxerto seja um processo muito dinâmico, variando entre indivíduos e tipos de doenças, o monitoramento do enxerto é uma forma de monitorar e, em última análise, influenciar as abordagens terapêuticas. 2,5,6 Tenho orgulho de poder contribuir com a equipe maravilhosa aqui na Northwestern University e me esforço para aprender mais sobre o processo - tanto clínico quanto no laboratório. Em artigos futuros, espero entrar em mais detalhes sobre o processo e outros ensaios que realizamos.

Obrigado por ler! Até a próxima vez! Fique bem e seguro durante esses tempos incertos!

  1. Life Technologies. 2014. Análise de fragmento de DNA por eletroforese capilar. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
  2. Kristt, D., Stein, J., Yaniv, I., & amp Klein, T. (2007). Avaliando o quimerismo quantitativo longitudinalmente: considerações técnicas, aplicações clínicas e viabilidade de rotina. Bone Marrow Transplantation, 39 (5), 255–268. doi: 10.1038 / sj.bmt.1705576
  3. Clark, JR, Scott, SD, Jack, AL, Lee, H., Mason, J., Carter, GI, Pearce, L., Jackson, T., Clouston, H., Sproul, A., Keen, L. , Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT e Barnett, D. (2015), Monitoramento de quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênicas (HSCT): Recomendações técnicas para o uso de técnicas baseadas em Short Tandem Repeat (STR), em nome do Serviço Nacional de Avaliação de Qualidade Externa para Leucócitos do Reino Unido Grupo de Trabalho de Quimerismo de Imunofenotipagem. Br J Haematol, 168: 26-37. doi: 10.1111 / bjh.13073
  4. Análise de repetição curta em tandem no laboratório de pesquisa. (2012). Recuperado em 10 de abril de 2020, em https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
  5. Breuer, S., Preuner, S., Fritsch, G., Daxberger, H., Koenig, M., Poetschger, U.,… Matthes-Martin, S. (2011). Teste de quimerismo de receptor precoce nas linhagens de células T e NK para avaliação de risco de rejeição de enxerto em pacientes pediátricos submetidos a transplante de células-tronco alogênicas. Leucemia, 26(3), 509-519. doi: 10.1038 / leu.2011.244
  6. Buckingham, L. (2012). Diagnóstico molecular: fundamentos, métodos e aplicações clínicas. Filadélfia: F.A. Davis Company.
  7. Rupa-Matysek, J., Lewandowski, K., Nowak, W., Sawiński, K., Gil, L., & amp Komarnicki, M. (2011). Correlação entre a cinética do quimerismo CD3 e a incidência da doença enxerto-versus-hospedeiro em pacientes submetidos ao transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas. Procedimentos de Transplante, 43(5), 1915–1923. doi: 10.1016 / j.transproceed.2011.02.011

-Ben Dahlstrom é graduado recentemente pelo programa NorthShore University HealthSystem MLS. Ele atualmente trabalha como tecnólogo molecular para a Northwestern University em seu laboratório de transplante, realizando tipagem HLA em transplantes de medula óssea e órgãos sólidos. Seus interesses incluem microbiologia, molecular, imunologia e banco de sangue.


Discussão

A primeira tecnologia de tipagem de DNA introduzida em meados dos anos 1980 foi RFLP. O método RFLP de tipagem de DNA envolveu unidades centrais de sequências consistindo de 30 a 100 nucleotídeos que estão presentes em muitas repetições (VNTR). O método RLFP de tipagem de DNA requer DNA genômico intacto em grandes quantidades (20 a 30 mg). No entanto, as amostras biológicas recebidas em um laboratório de ciência forense são geralmente agredidas ambientalmente e, ocasionalmente, apenas pequenas quantidades de DNA podem ser obtidas. Portanto, em muitas situações, o método RFLP não pôde ser aplicado.

O método de tipagem de DNA atualmente em uso é a tipagem STR. Neste método, muitos loci compostos por unidades centrais de nucleotídeos repetidos até um comprimento de 80 a 400 pares de bases podem ser co-amplificados e os resultados podem ser obtidos no mesmo dia por análises automatizadas de fragmentos de DNA. Esta tecnologia é mais superior do que o método RFLP porque requer pequenas quantidades de DNA (0,5 a 1 ng) e amostras degradadas também podem ser testadas.

A análise de DNA tem sido fundamental para garantir condenações em centenas de crimes violentos, de homicídios a agressões. Também ajudou a eliminar suspeitos e levou à exoneração e libertação de indivíduos anteriormente condenados. O DNA pode concentrar as investigações e provavelmente encurtará os julgamentos e levará a confissões de culpa. Também pode impedir que alguns infratores cometam crimes graves. O aumento do uso de evidências de DNA forense levará a economias de longo prazo para o sistema de justiça criminal.

Por meio do armazenamento de dados de DNA em bancos de dados de computador, a análise de DNA pode ser usada para solucionar crimes sem suspeitos. Cientistas forenses podem comparar perfis de DNA de amostras de evidências biológicas com um banco de dados para auxiliar a polícia na detecção de suspeitos. Um banco de dados também permitiria que crimes anteriores não resolvidos em que as evidências de DNA tivessem sido encontradas, mas não estivessem relacionadas com o criminoso, fossem esclarecidos se as amostras de DNA colhidas de um suspeito em conexão com um crime posterior correspondessem às evidências encontradas na cena do crime anterior . Um banco de dados nacional de DNA também ajudaria a polícia a identificar infratores em série tanto dentro quanto em todo o país.

A análise forense de DNA é realizada em todo o mundo. Portanto, é imperativo da parte das nações em desenvolvimento, incluindo a Malásia, desenvolver e compilar um banco de dados nacional de DNA consistindo em & # x0201c índice de perfil de DNA de cena de crime & # x0201d, & # x0201c índice de perfil de DNA de infrator condenado & # x0201d, e um índice contendo perfis de DNA de corpos e partes do corpo não identificados. Esse esforço, por sua vez, garantirá emendas apropriadas nas leis criminais para ajudar as agências de aplicação da lei a identificar pessoas que supostamente cometeram crimes graves e violentos e capacitar a coleta de amostras para banco de dados de perfis de DNA. Até o momento, já existem dados publicados para 9 STRs para três grupos étnicos da população da Malásia (malaio, chinês e indianos) (21, 22) e esforços estão em andamento para tipificar subpopulações de malaios e iniciar o perfil de 15 STR recentemente validado kit em várias populações na Malásia. Uma extensa base de dados e perfis de DNA de criminosos e indexá-los ajudará a acelerar a detecção de crimes.


Como funciona a evidência de DNA

Da cena do crime, um pedaço de evidência de DNA viaja para um laboratório forense. Esses laboratórios variam um pouco, tanto em termos de como são estruturados quanto no tipo de análises que oferecem. Os laboratórios públicos são frequentemente associados a uma entidade de aplicação da lei ou ao Ministério Público, enquanto outros são entidades governamentais independentes. Laboratórios forenses privados, alguns dedicados apenas à análise de DNA, também existem.

Muitos laboratórios têm a capacidade de realizar testes de DNA nuclear, que é a cópia do DNA que existe no núcleo de cada célula. Mas apenas alguns laboratórios oferecem técnicas mais especializadas, como cromossomo Y ou análise de DNA mitocondrial. Vejamos algumas dessas técnicas com mais detalhes.

Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) análise foi um dos primeiros métodos forenses usados ​​para analisar DNA. Ele analisa o comprimento das fitas de DNA que incluem pares de bases repetidos. Essas repetições são conhecidas como número variável repetições tandem (VNTRs) porque eles podem se repetir em qualquer lugar de uma a 30 vezes.

A análise de RFLP requer que os investigadores dissolvam o DNA em uma enzima que quebra a fita em pontos específicos. O número de repetições afeta o comprimento de cada fita de DNA resultante. Os investigadores comparam amostras comparando os comprimentos dos fios. A análise RFLP requer uma amostra bastante grande de DNA que não foi contaminada com sujeira.

Muitos laboratórios estão substituindo a análise RFLP por repetição tandem curta (STR) análise. Esse método oferece várias vantagens, mas uma das maiores é que pode começar com uma amostra muito menor de DNA. Os cientistas amplificam esta pequena amostra por meio de um processo conhecido como reação em cadeia da polimerase, ou PCR. O PCR faz cópias do DNA da mesma forma que o DNA se copia em uma célula, produzindo quase qualquer quantidade desejada de material genético.

Uma vez que o DNA em questão foi amplificado, a análise de STR examina a frequência com que os pares de bases se repetem em loci ou locais específicos em uma fita de DNA. Estes podem ser repetições de dinucleotídeo, trinucleotídeo, tetranucleotídeo ou pentanucleotídeo - isto é, repetições de dois, três, quatro ou cinco pares de bases. Os investigadores frequentemente procuram por repetições de tetranucleotídeos ou pentanucleotídeos em amostras que passaram por amplificação por PCR, porque essas são as mais prováveis ​​de serem precisas.

O Federal Bureau of Investigation (FBI) escolheu 20 loci STR específicos para servir de padrão para a análise de DNA. Eles expandiram esse número de 13 para 20 em janeiro de 2017.


Tipagem STR: método e aplicações

A incursão deste mês pelo The Primer em técnicas de diagnóstico molecular abrangerá um método conhecido como tipagem de repetição em tandem curta (STR). A tipagem de STR é um método mais comumente aplicado para trabalho forense molecular, mas é cada vez mais usado também no laboratório de patologia molecular como um método para usar (ou recorrer, conforme necessário) para rastrear e / ou confirmar a "identidade" do tecido amostras. Enquanto o primeiro aplicativo obtém mais tempo de tela na TV e filmes, é no último contexto que mais leitores provavelmente encontrarão o método. No entanto, como veremos, o método real é idêntico em ambos os usos.

Compreendendo repetições curtas em tandem

Começamos considerando o que um STR realmente é. Em todo o genoma humano, há um grande número de lugares ("loci") onde as sequências de DNA não codificantes consistem em um elemento nucleotídeo curto (geralmente 3 ou 4), como "CGG" ou "ACAG", que ocorre como um conjunto de repetições concataméricas. Para nossos exemplos, seria “CGGCGGCGG… .CGG” e “ACAGACAGACAG… .ACAG”, respectivamente. Quando a replicação do DNA ocorre por meio desses tipos de elementos, um tipo particular de erro pode ocorrer: se a fita nascente (em crescimento) se desprender do molde momentaneamente, quando ela recozer, pode efetivamente fazê-lo com um "deslizamento" por alguma unidade número de repetições, permitindo que quase todo o emparelhamento de bases seja restabelecido. Ou seja, após a desnaturação e reanimação do filamento nascente ao molde, a polimerase pode estar “à frente” ou “atrás” de onde estava quando saiu. Conforme a replicação começa novamente, a fita nascente “pulou” algumas das repetições do modelo ou as leu duas vezes como modelo. O primeiro resulta em uma fita filha de DNA com uma perda de um número unitário de repetições STR, enquanto o segundo produz uma fita filha com um número aumentado de repetições STR.

Com que frequência esse “deslizamento” da polimerase ocorre em uma região STR? A frequência pode variar com vários fatores, mas a resposta geral é: rara, mas com frequência suficiente para que uma população exiba uma faixa de números de repetição STR em um determinado locus.

Embora os loci STR ocorram espalhados por todo o genoma humano, um pequeno número é particularmente bem compreendido. Estes são aqueles que ocorrem em uma região flanqueada por sequências únicas altamente conservadas, de modo que as sequências únicas não estão muito próximas, e não muito distantes, para a amplificação de PCR eficaz com base em iniciadores contra as regiões únicas (cerca de 50 a 500 bases pares). Quando um elemento STR como este existe, é possível projetar primers de PCR contra as regiões conservadas flanqueadoras e saber que (graças à conservação) o conjunto de primers amplificará um produto de qualquer amostra de DNA humano intacta. Na verdade, quando os loci STR em questão estão em um autossomo como a maioria está, então uma amostra de DNA humano terá duas cópias de loci (uma de DNA derivado de mãe e outra de derivado paterno), então dois produtos de PCR serão amplificados. O detalhe importante aqui é que, embora saibamos que um produto PCR (ou dois produtos) se formará, não sabemos a priori quanto tempo os produtos serão. Esse comprimento dependerá do número de repetições de STR entre os locais do iniciador de PCR. Os loci STR mais úteis são aqueles onde estudos populacionais mostraram uma ampla diversidade de número de repetições encontradas - digamos, 5 a 30. Esta faixa de 25 "números de repetição" para um elemento de repetição de trinucleotídeo levaria a uma faixa de 75 pares de base ( ou seja, 25 x 3) de tamanhos de amplicon possíveis, em etapas de três bases por repetição.

Conhecidos por nomes de loci como "D1S80" ou às vezes por genes próximos "TPOX", um punhado de loci STR atende a esses critérios de utilidade e são bem estudados, com conjuntos de primers publicados para sua amplificação e estatísticas populacionais conhecidas para números de repetição individuais em cada locus - isto é, para um locus, em uma determinada população étnica, alguns números repetidos são comumente encontrados e outros são menos comumente encontrados.

Encontrando uma impressão digital de DNA

Com isso em mente, imagine que pegamos um conjunto de iniciadores para um locus STR autossômico e realizamos um PCR de ponto final simples em uma amostra humana. No final do PCR, analisamos o tamanho dos produtos de PCR. Uma vez que estamos procurando por etapas de 3 ou 4 nt, a eletroforese em gel não nos dará resolução boa o suficiente para distinguir produtos que diferem por um ou dois números de repetição, então empregamos sequenciadores de eletroforese capilar para ler os tamanhos dos produtos exatamente ao nucleotídeo. Nossa amostra pode mostrar um produto de tamanho único (indicando que ambas as cópias de loci tinham o mesmo número de repetição), ou pode mostrar dois produtos, diferindo em números de repetição (figura 1) Para os loci examinados, agora sabemos os números de repetição associados a essa amostra de DNA.

Agora imagine que pegamos uma segunda amostra de DNA e repetimos o experimento. Se o fizermos, e obtivermos um resultado diferente do que na primeira amostra, temos a conclusão inevitável de que as duas amostras de DNA vêm de indivíduos diferentes. Se, em vez disso, obtivermos os mesmos resultados da primeira amostra, não podemos, entretanto, dizer que as amostras são do mesmo indivíduo. Isso porque é possível (em algum nível estatístico, dependendo da frequência populacional do resultado obtido para este locus) que outra pessoa teve os mesmos números de repetição que esses loci.

A técnica ganha força quando testamos vários locais STR em cada espécime. A probabilidade de duas amostras coincidirem exatamente diminui rapidamente à medida que examinamos mais loci. Um teste STR comercial comumente usado examina 16 loci (15 autossômicos e um caso especial cromossômico sexual discutido mais abaixo) com taxas de especificidade reivindicadas (isto é, probabilidade de dois indivíduos corresponderem a todos os loci) de 1 em 1,8 × 10 17 indivíduos ou mais— ou seja, muitas vezes a população humana total do planeta! Comumente chamada de “impressão digital de DNA”, com probabilidades dessa escala, não é de se admirar que as evidências de DNA sejam cada vez mais aplicadas em usos forenses e criminais - tanto em entretenimentos populares quanto em estudos forenses da vida real.

Relacionamentos significativos

Além de determinar (ou refutar) a identidade entre duas amostras, a técnica também pode ser usada para determinar a relação. Metade dos números de repetição de loci STR de qualquer indivíduo deve corresponder aos valores da fonte materna e a outra metade da fonte paterna. Os irmãos geralmente devem corresponder uns aos outros em um quarto dos loci, e assim por diante, por meio de relações genéticas mendelianas simples. A análise estatística detalhada (incluindo a frequência da população dos tipos específicos de STR observados) pode ser empregada para refinar dados desse tipo e provar ou refutar os níveis de parentesco entre as amostras, para uma probabilidade estatística conhecida. Observe que desde de novo Eventos de deslizamento de STR e / ou erros experimentais podem ocorrer, uma única incompatibilidade com os valores esperados não refuta definitivamente a relação, uma correspondência entre os loci restantes pode ainda ser suficiente para ter uma alta certeza de relação.

Agora que entendemos como essa metodologia é aplicada às aplicações populares, que tal as mais mundanas? O poder e a simplicidade do método de "impressão digital" STR, combinado com sua disponibilidade em formatos de kit otimizados pré-fabricados facilmente executados em equipamentos de laboratório já geralmente presentes no laboratório de patologia molecular, torna-o uma ferramenta útil para rastrear e / ou confirmar parentesco em amostras (ou pedaços de amostras). Considere um caso como uma biópsia de tumor potencial, onde vários pequenos pedaços de tecido podem ser incorporados em um único bloco FFPE. A análise imunohistoquímica de rotina é feita e o resultado mostra que a maioria dos pedaços de tecido não são cancerosos, enquanto um único pedaço é. Em casos como este, uma preocupação cruzando a mente do patologista pode ser se todos os pedaços de tecido são de fato da mesma amostra - ou se um "flutuador" de outro caso de alguma forma entrou no bloco? Embora cuidadosamente protegidos, tais casos não são impossíveis e podem ter consequências graves para o paciente. O método de tipagem STR pode ser uma ferramenta muito útil em um caso como este, em que uma seção microscópica do pedaço de tecido em questão pode servir como um modelo para uma impressão digital de DNA, com uma amostra de referência do paciente fornecendo outra. Uma correspondência confirma a “relação” (ou não) da peça de tecido e o paciente, garantindo o diagnóstico corretamente atribuído.

Um locus STR particular nos cromossomos sexuais foi mencionado acima. Ocorrendo dentro do gene da amelogenina, este não é estritamente um STR clássico em que o tamanho de um elemento de repetição pode variar. Acontece que a versão do gene da amelogenina carregada no cromossomo X (AMELX duas vezes em mulheres e uma vez em homens) não é precisamente idêntico ao comprimento da mesma região do gene da amelogenina carregada no cromossomo Y (AMELY uma vez nos homens). Um intron em AMELY contém uma inserção de 6 bases em relação ao mesmo intron em AMELX. (Observe que, como a inserção é em um íntron, as porções do gene codificador são idênticas.) Quando amplificados por primers que flanqueiam essa região, os produtos derivados de AMELY são, portanto, 6 bp mais longos do que os derivados de AMELX. O conjunto de iniciadores mais comumente usado para este locus produz assim um único produto de 106 bp (duas cópias de loci, mesmo tamanho) para amostras de DNA de fêmeas e um produto de dupleto de 106/112 bp (um de cada locus) de machos. Este teste de locus único, portanto, efetivamente rege (ou exclui) cerca de metade da população como fontes possíveis para qualquer amostra de DNA, e é rotineiramente incluído em painéis de tipagem STR. Dado seu tamanho, este locus também é pouco diferenciável em um gel de agarose com boa técnica, tornando-se uma boa demonstração em sala de aula da abordagem geral, sem a necessidade de acesso a um instrumento sequenciador capilar.

E quanto a amostras mistas? O método descrito acima assumiu que cada amostra testada provém de uma única fonte e funciona melhor nesta situação “perfeita”. No entanto, em casos da vida real com pequenas quantidades proporcionais de outro DNA presente, o método ainda funciona. O gabarito primário produzirá a maior parte do produto, com pequenas quantidades de produto surgindo do gabarito contaminante. Os sequenciadores capilares mostram a área real do pico para cada produto detectado, de modo que a amostra primária mostrará um conjunto principal de picos com pequenos picos laterais atribuíveis ao contaminante.

Voltou para figura 1: um esboço de resultados de STR hipotéticos para quatro marcadores de STR "A", "B," "C" e "D." As amostras 1, 2 e 3 representam três amostras diferentes testadas para esses marcadores, como os resultados da eletroforese capilar bruta. Cada amostra contém dois padrões de tamanho fixo, “R1” e “R2”, que são usados ​​para garantir o alinhamento dos resultados entre as amostras. Cada eletroferograma mostra a intensidade do sinal vs. o tamanho do produto e é dividido nas regiões “A”, “B”, “C” e “D”. Cada região representa o intervalo esperado de tamanhos de amplicon possíveis do marcador STR de mesmo nome. Considerando a Amostra 1, pode-se ver que a fonte é heterozigótica para tamanhos de STR nos marcadores A, C e D, (dois produtos distintos formados em tamanhos específicos), mas é homozigótica para ambos os alelos do marcador B. (Existem dois produtos, mas de tamanho idêntico, produzindo um único pico.) A Amostra 2 teria parentesco genético muito baixo com a Amostra 1, observe que, nesta amostra, os marcadores STR B, C e D são heterozigotos, enquanto A é homozigoto, e que em geral, poucos de qualquer tamanho de alelo se alinham entre as Amostras 1 e 2. Em contraste, a Amostra 3 é exatamente igual à Amostra 1, sugerindo identidade (ou, pelo menos, um alto grau de parentesco). Um resultado de STR real seria semelhante a este, mas com mais marcadores, permitindo maior poder estatístico na detecção de desvinculação.

John Brunstein, PhD, membro da MLO Conselho Consultivo Editorial, é Presidente e CSO da PathoID, Inc., sediada em British Columbia


Roepat Str - História

A maior parte do nosso DNA é idêntico ao DNA dos outros. No entanto, existem regiões herdadas de nosso DNA que podem variar de pessoa para pessoa. Variações na sequência de DNA entre indivíduos são denominadas "polimorfismos". Como iremos descobrir nesta atividade, as sequências com o maior grau de polimorfismo são muito úteis para análise de DNA em casos forenses e testes de paternidade. Esta atividade é baseada na análise da herança de uma classe de polimorfismos de DNA conhecidos como "Short Tandem Repeats", ou simplesmente STRs.

STRs são sequências curtas de DNA, normalmente de comprimento de 2-5 pares de bases, que são repetidas várias vezes em forma de cabeça-cauda, ​​ou seja, a sequência de 16 bp de "gatagatagatagata" representaria 4 cópias cabeça-cauda do tetrâmero "gata" . The polymorphisms in STRs are due to the different number of copies of the repeat element that can occur in a population of individuals.

D7S280

D7S280 is one of the 13 core CODIS STR genetic loci. This DNA is found on human chromosome 7. The DNA sequence of a representative allele of this locus is shown below. This sequence comes from GenBank, a public DNA database. The tetrameric repeat sequence of D7S280 is "gata". Different alleles of this locus have from 6 to 15 tandem repeats of the "gata" sequence. How many tetrameric repeats are present in the DNA sequence shown below? Notice that one of the tetrameric sequences is "gaca", rather than "gata".


TH01

We have made and will continue to make great efforts to ensure the accuracy and completeness of the data included in this STR database. Information will be added from time-to-time to keep this site as up-to-date as possible. The National Institute of Standards and Technology (NIST) is in no way responsible for information provided through this site, including hyperlinks to commercial sources of materials. Certain commercial vendors are identified in this web site to benefit the DNA typing community. In no case does such identification imply a recommendation or endorsement by NIST nor does it imply that the material, instrument or equipment identified is necessarily the best available for human identity testing.

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The Geriatric Patient

Steven J. Schwartz MD , Frederick E. Sieber MD , in Anesthesia and Uncommon Diseases (Sixth Edition) , 2012

Diagnosis and Differential

The DNA-repeat expansion forms the basis of a diagnostic blood test for the disease gene. Patients having 38 or more CAG repeats in the Huntington's disease gene have inherited the disease mutation and will eventually develop symptoms if they live to an advanced age. Each of their children has a 50% risk of also inheriting the abnormal gene a larger number of repeats is associated with an earlier age at onset. Huntington's can also be diagnosed by caudate atrophy on magnetic resonance imaging (MRI) in the context of an appropriate clinical history.

Differential diagnosis of Huntington's disease includes other choreas, hepatocerebral degeneration, schizophrenia with tardive dyskinesia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other primary dementias and drug reactions.


Performing STR Analysis

This method differs from RFLP since in STR analysis DNA is not cut with restriction enzymes. Probes are attached to preferred regions on the DNA, and a PCR is employed to discover the lengths of the short tandem repeats.

The whole process for STR typing comprisesof collection of sample, extraction of DNA, quantisation of DNA, amplification of multiple STR loci by PCR, separation and sizing of STR allele, STR typing followed by profile interpretation, and possibly a report of the statistical significance of a match. Current forensic systems apply 10 (e.g. United Kingdom) or 13 (e.g. United States) STR loci. Kits with PCR primers for the standard STR loci are available commercially.

Numerous PCR reactions are performedconcurrently in a single tube at different STR loci, which give several products (two for each locus). The required components are as follows:

§ A DNA sample, e.g. blood or buccal cells from a suspect or a tissue, hair, nail from the scene of a crime

§ Two oligonucleotide PCR primers: one unlabelled reverse primer and one primer labelled at the 5 ′ -end with 32 P

§ A DNA polymerase (thermos table)

§ Four deoxynucleoside triphosphates which are as follows: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

The labelled PCR products separate according to size when run on a polyacrylamide gel. DNA ladder is obtained and works as characteristic of an individual (Fig.7) .



Repeat specific rows or columns on every printed page

If a worksheet spans more than one printed page, you can label data by adding row and column headings that will appear on each print page. These labels are also known as print titles.

Follow these steps to add Print Titles to a worksheet:

On the worksheet that you want to print, in the Page Layout tab, click Print Titles , no Configurações da página group).

Observação: The Print Titles command will appear dimmed if you are in cell editing mode, if a chart is selected on the same worksheet, or if you don’t have a printer installed. For more information about installing a printer, see finding and installing printer drivers for Windows Vista. Please note that Microsoft has discontinued support for Windows XP check your printer manufacturer's Web site for continued driver support.

No Folha tab, under Print titles, do one—or both—of the following:

No Rows to repeat at top box, enter the reference of the rows that contain the column labels.

No Columns to repeat at left box, enter the reference of the columns that contain the row labels.

For example, if you want to print column labels at the top of every printed page, you could type $1:$1 no Rows to repeat at top caixa.

Tip: Você também pode clicar no Collapse Popup Window buttons at the right end of the Rows to repeat at top e Columns to repeat at left boxes, and then select the title rows or columns that you want to repeat in the worksheet. After you finish selecting the title rows or columns, click the Collapse Dialog button again to return to the dialog box.

Observação: If you have more than one worksheet selected, the Rows to repeat at top e Columns to repeat at left boxes are not available in the Configurações da página caixa de diálogo. To cancel a selection of multiple worksheets, click any unselected worksheet. If no unselected sheet is visible, right-click the tab of a selected sheet, and then click Ungroup Sheets on the shortcut menu.